【 摘要】 目的 观察伴放线放线杆菌( Actinobacillus actinomycetemcomitans，Aa) 从粗糙型到光滑型的转变过程，识别An在实验室传代过程中出现的不同生长形态。方法从牙周炎患者龈下菌斑中分离出的原代菌株8株，应用固体及液体培养基连续传代，液体培养每次传代的同时接种固体培养基观察相应的菌落形态。结果液体培养获得3株光滑型转变株。菌落的变化从粘附的小菌落到沉淀的大菌落到完全的均匀生长，转化过程大约需要7～8代。在这一过程中相应传至固体培养基上生长的从粘附的半透明的小菌落变大、不透明并失去粘附的特性，又随着边缘的扩散变为扁平，透明度也增加；与此同时内部的星形结构逐渐变简单、变小，最后消失。固体培养未获得典型的转变株。结论An从粗糙型到光滑型的转变是一个菌落湿度逐渐增加，体积逐渐增大，并逐渐失去内部结构的过程。这一过程至少可以看到半透明突起的粗糙型、不透明突起的光滑型和近乎透明的扁平光滑型3种菌落形态。
【关键词】 放线杆菌，伴放射菌；形态发生；牙周炎；牙菌斑
伴放线放线杆菌( Actinobacillus actinomycetemcomitans，Aa ) 是一种革兰阴性的球杆菌，嗜二氧化碳、微氧或厌氧环境生长［1］。Aa可以引起一些严重的全身感染，如心内膜炎、心包炎、脑脓肿、脑膜炎、骨髓炎、甲状腺脓肿及泌尿系感染等［2］。目前有多方面的证据表明Aa与牙周病之间的相互关系，特别是侵袭 性 牙周 炎。1999年美国牙周病学会公布的新的牙周病分类标准将Aa列为侵袭性牙周炎的实验室参考诊断指标［3］。
在体外培养中，Ao至少可以观察到两种主要形态［4］。从龈下菌斑中新分离出的菌落形态为粗糙型，典型的表型特征是菌落突起、灰白、半透明、内部呈星形结构；在体外长期传 代培养的菌落则为光滑型、不粘附、内部无星形结构。菌落形态的差异一般伴随细菌表面结构及成分的不同，进而可能影响到细菌致病性的变化［？］。我们在伴放线放线杆菌早期进行的分离培养研究中也注意到这种形态差异。同时在最近的研究中发现，Aa在实验室传代过程中形态变化很大，从粗糙型到光滑型的转变过程中还存在中间形态，如果不熟悉这些特 点，往往误以为是其他的污染菌而放弃继续传代。所以熟悉Aa的形态学变化无论对于临床诊断还是实验室研究都是最基本、最重要的一步。我们通过对Aa临床菌株从粗糙型到光滑型转变的连续观察，认识和描述Aa在实验室生长的不同形态特点，为Aa鉴定及Aa与牙周病关系研究中实验菌株的选择提供参考。
材料与方法
1． 菌株：①实验室参考菌株：Aa ATCC43718，ATCC33384。②临床菌株：伴放线放线杆 菌M1-5，M1-1，M2-4，M2-2，M3-1，M3-5，C6-1，C6-2分离自2例牙周炎患者。以上菌种均由日本鹤见大学齿学部细菌室提供。粗糙型菌株均为固体培养第2代冻存菌株。
2． 细菌的培养：应用Aa TSBV选择性培养基复苏冻存的粗糙型菌株，挑取一典型菌落，分别接种固体和液体的培养基。固体培养基4d传代1次，液体培养基1～2 d传代1次。液 体培养每次传代前充分震荡，分别取一接种环接种固体及液体培养基。
3． 细菌的鉴定：粗糙型菌株根据TSBV培养基上生长，粘附，内部呈星形结构，触酶阳性及PCR鉴定。转变后的菌株主要根据TSBV培养基上生长，触酶阳性，PCR鉴定及SDS- PAGE鉴定。
4． PCR：选择伴放线放线杆菌16SrRNA引物5′- GTTAGCCCTGGTGCCCGAAG一3′和5′- TGACGGGCGGTGTGTACAAGG-3′。PCR循环：预变性95℃ 3min，变性95℃ 1min，复性55℃1min，延伸72℃1 min，最后延伸72℃ 10 min［6］。
5． SDS．PAGE：样品加入等量的样品缓冲液0．125 mol／L Tris-HC1( pH 6．8 )，4％SDS，20％甘油，10％巯基乙醇，100℃加热5min。电泳胶浓度为15％。结果观察用0．025％的考马斯亮蓝染色。
结 果
1．通过液体传代10次左右，从粗糙型菌株 M2-4、M3-5、 C6-2获得3株光滑型转变株， 分别命名为M2-4 S、M3-5S、C6-2S。其他菌株处于不同的转化阶段。菌株的全细胞SDS．P AGE鉴定3株粗糙型菌株及相应的3株转变株与实验室参考菌株ATCC43718及ATCC3338 4蛋白带型一致。
2．伴放线放线杆菌生长的形态学变化的规律：
(1) 原代菌株：An从龈下菌斑中新分离出的细菌菌落灰白，半透明，突起，菌落一般比较小，比较紧密，内部呈星形结构。固体培养菌落紧紧粘附到培养基表面，液体传代菌落粘附到管壁上生长，液体清亮。
(2) 液体培养菌株的转变：最初的变化是菌落沉淀生长，随着传代次数的增加菌细胞量明显增多，但液体仍保持清亮。大约经过7～8代，细胞开始均匀生长，沉淀的细胞量开始减少。一般经过10代左右细胞完全转化成均匀生长，继续传代不再发生变化。不同菌株之间转化快慢存在差异。
(3)液体传代固体培养观察菌落的变化过程：主要有两步。第一步菌落突起变大，颜色加深，在固体培养基上的粘附性明显降低， 内部星状结构趋于简单不典型至逐渐变小呈橄榄形或三角形或完全消失。第二步菌落边缘逐渐扩散，菌落形态可以形成草帽状，内部可能仅留一脐状结构，最终脐状结构会完全消失。完全扩散开后菌落呈扁平、湿润、半透明或近乎透明状。
(4) Aa菌落内部星状结构变化与Aa在固体与液体培养条件下的生长特点见。
讨 论
1990年Inouye等［7］最早报道Aa存在3种菌落形态，包括半透明的粗糙型和光滑型、不透明的光滑型。半透明的粗糙型内部存在星形结构，反复传代可产生两种菌落形态，即半透明和不透明的光滑型。 并发现半透明的光滑型可产生不透明的光滑型，但是不透明光滑型不产生半透明光滑型。这些菌落的粘附生长情况也不同。半透明的粗糙型及光滑型紧密粘附平板或试管壁长，不透明光滑型不粘附，液体培养也呈均匀生长。我们在实验中动态观察了Aa的形态学变化，发现从粗糙型转变成完全的扁平光滑型主要有两步：首先菌落逐渐增大，内部结构趋于简单，其透光度从半透明到不透明，颜色也从灰白到桔黄；随着菌落湿度的增大，菌落逐渐从边缘放开，由突起逐渐变扁平，透光度也逐渐增加。总结这种变化也主要包括了3种菌落形态，半透明的粗糙型、作为中间形态的不透明的光滑型，及作为最终形态的半透明或近乎透明的光滑型。本研究表明，菌落透明度的变化可能主要与菌落的大小及突起状况有关，从粗糙型到光滑型，菌落从小到大，但最初是突起变大，菌落透光度小了，外观自然从半透明变为不透明。随着菌落的放开、变平，菌落又逐渐变为半透明或近乎透明。所以不透明的光滑型实际是一种中间形态，在这种形态下，菌落逐渐湿润，不粘附或至少是粘附性降低了。
Haase等［8］最近描述了Aa液体培养的形态学变化。Aa经历从自动凝集的小颗粒的粘附生长、大颗粒的半沉淀生长、完全沉淀生长、少量的沉淀但主要是均匀生长、到最终变为均匀生长的过程。在开始均匀生长之前，液体一直是清亮的。我们观察这种液体的形态学变化与固体培养的形态学变化是一致的。菌落开始变大突起，粘附性降低，表现在液体中自然是沉淀生长并且量也多， 因菌落还是凝集生长并未放开， 所以液体清亮。到菌落完全放 开生长后液体均匀，不再出现沉淀。
Aa从粗糙型到光滑型的转变有一个过程。一般液体培养较容易发生转变，大约l0代左 右。在我们的研究中，单纯固体传至20多代虽然有的菌株星形结构已不典型，粘附不明显，但还未转变成光滑型。与液体培养基相比，固体培养可能需要足够长的时间才能发生完全的转变。
细菌可以存在时相的变化，如一些肠道细菌［9］。但到目前为止，尚未见到Aa从光滑型转化成粗糙型的报道。在我们的研究中， Aa可以从粗糙型转变成光滑型，但转化成光滑型后固体及液体继续传代培养均未发现进一步的变化。另外光滑型比粗糙型菌株更容易生长，具有更强的生长活力。
Aa形态学鉴定主要根据其粘附和内部的星形结构，但光滑型的两种类型均不具有这些特点，在转化过程中往往很难判定是转化菌还是污染菌，所以我们应用了16 S rRNA PCR及全细胞蛋白SDS．PAGE等方法监测转化过程和鉴定转化结果。
粘附是细菌致病的一个重要特点，特别是在口腔存在唾液流动的环境中粘附定居是细菌致病的第一步。Aa粗糙型体外培养粘附生长，是否比光滑型具有更强的致病性还需要进一步研究。细菌的致病性是相对的，致病因子的表达也需要一定条件。体外培养菌株由于条件的变化某些致病特点可能不典型或消失。我们在最近的试验中也观察到，粗糙型菌株存在丰富的菌毛，而光滑型菌株菌毛少或消失，一般认为菌毛是细菌直接参与粘附的一个重要粘附因子［10］；另外粗糙型和光滑型菌株外膜蛋白也存在很大差异。这些变化提示细菌致病性的可能变化，应进一步从分子水平上探讨A a表型变化对其致病性的影响。
表1 Aa菌落内部星状结构变化与Aa在固体与液体培养条件下的生长特点
内部结构
固体培养
液体培养
菌落大小（mm）
形态
颜色
透明
粘附
菌落生长状态
培养基
星状结构
1~2
突起
灰白
半透明
明显
粘附管壁生长
清亮
多行
2~3
突起
桔黄
不透明
下降
沉淀生长
清亮
脐状
2~3
冒状
淡黄白
半透或近透明
不粘附
沉淀或开始均匀
尚清
无
3~4
扁平
淡黄白
半透或近透明
不粘附
均匀生长
浑浊
作者：王者玲 Nobuko Maeda Tomoko Ohshima Ayako Takao 杨圣辉 李金路《中华口腔医学杂志》
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